Лечение, Болезни, Лекарства, Инструкция   -  Справочник
Лечение, Болезни, Лекарства, Инструкция   -  Справочник
Призер
Интернет-фестиваля
национального домена UZ
На главную Cтраница : Главная | Медицинские статьи | Фундаментальная медицина | Стволовые клетки и молекулярная биология
Лечение, Болезни, Лекарства, Инструкция   -  Справочник Лечение, Болезни, Лекарства, Инструкция   -  Справочник
Популярные компании
Санаторий Мерсиан

Санаторий Мерсиан основан в 2007 году Узбекско-Корейским совместным предприятием на месте бывшей обл   

Неврологическая клиника SPECTRA NEVROLOGY

Стационарное лечение остеохондроза и грыжи позвоночника   

Клиника SABA DARMON

Юкори малакали, бепуштлик даволашда 20 йиллик тажрибага эга шифокорлар сизга, арзонлаштирилган нархларда куйидаги хизматлар курсатади.   

Неврологическая клиника NeyroMED Servis

Специализированный медицинский центр NeyroMED Servis, предоставляет высококвалифицированные неврологические услуги.   

Министерство здравоохранения Республики Узбекистан

Министерство здравоохранения Республики Узбекистан (далее по тексту Министерство) является центральн   

Новые консультанты
Амбарцумов Левон Валерьевич
Врач-психиатр, Ташкентская Республиканская психиатрическая больница с интенсивным наблюдением
Зокирхонов Шахзод Дилшод угли
Сосудистый хирург, флеболог
Диагностика и лечение любых заболеваний сосудов
Лечение варико

Хакимов Азизбек Азимович
Врач Реабилитолог-ЛФК
ЛФК при грыже позвоночника
ЛФК при сколиозе
ЛФК при артрозе(гон

Жаннатиллаев Сардор
pediatr

Стволовые клетки и молекулярная биология



Писаржевский С.А.
Институт атеросклероза

1.МОЛЕКУЛЯРНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК.

В настоящее время для изучения стволовых клеток особое значение приобрели следующие молекулярно биологические методы: интерференция РНК и техника микрочипов, а также метод генных ловушек, протеомный анализ, генетическая трансформация.

1.1.Интерференция РНК.

Интерференция РНК – это механизм, имеющий место в большинстве эукариотических клеток для избавления от чужеродных двухцепочных молекул РНК. В течение шести лет после первого сообщения об интерференции РНК было продемонстрировано, что она изменяет экспрессию генов в клетках млекопитающих и широкого спектра эукариот, и ее использовали, как средство генетических исследований точно так же, как возможную стратегию генетической коррекции/53/.

Интерференция РНК (RNAi) была признана мощным орудием идентификации функции генов во многих биологических процессах, она может быть использована для широких генетических исследований в клетках млекопитающих. Для этих целей кассеты, которые индуцируют RNAi, могут быть эффективно введены в геном клеток хозяина с использованием вирусных векторных систем, что приводит к подавлению экспрессии генов – мишеней. Временное подавление экспрессии генов может быть также индуцировано экзогенным введением подходящих триггеров RNAi в клетки – мишени/39/.

Интерференция РНК(RNAi), эволюционно крайне консервативный процесс транскрипционного (путем метилирования ДНК) и посттранскрипционного подавления активности гена, может быть запущен малыми интерферирующими РНК(siRNA), которые опосредуют последовательность - специфичную деградацию иРНК. Со времени первого сообщения в 1998 году RNAi быстро развилось в эффективный инструмент для специфичного выключения экспрессии генов у большого разнообразия клеток – мишеней. В соответствии с этим RNAi в настоящее время используется как для систематического функционального анализа генома у некоторых организмов, так и для специфического терапевтического вмешательства в преклинических моделях различных болезней, характеризуемых нарушенной экспрессией генов. Однако поскольку siRNA не реплицируется в клетках млекопитающих в течение процесса интерференции РНК, кинетические аспекты siRNA – индуцированного подавления активности генов, которые, в конечном счете, зависят от внутриклеточного уровня siRNA, должны быть рассмотрены для каждого аналитического или терапевтического приложения в этих клетках/40/.

Интерференция РНК(RNAi) является последовательность – специфичным подавлением активности генов, индуцированным двухцепочечной РНК(dsRNA), которая быстро дает информацию о функции генов .

Использование RNAi для генной терапии широко изучается, в особенности при вирусных инфекциях, опухолях и наследственных генетических заболеваниях. RNAi использовалась для получения мышей c нокдауном для изучения функционирования генов в целом животном. Совместно с данными геномики подавление активности генов с помощью RNAi может способствовать определению функции любого гена, экспрессируемого в клетке.

Термин RNAi появился в связи с открытием, что инъекция dsRNA у Caenorhabditis elegans интерферирует с экспрессией специфических генов, содержащих комплементарную область в введенной dsRNA. У млекопитающих введение длинных dsRNA (длиннее, чем 30 нуклеотидов) вызывает неспецифический интерфероновый ответ, что приводит к приостановлению экспрессии всех генов и гибели клетки. Группа Tom Tuschl обнаружила, что трансфекция синтетической 21 – нуклеотидной двухцепочечной РНК(siRNA) была высоко специфичной и являлась последовательность - специфичным ингибитором эндогенных генов в клетках млекопитающих. Экспрессия РНК, подавляющих транскрипцию, изучалась с помощью РНК из плазмид и вирусных векторов. Они доставляют подавляюшую экспрессию РНК как в делящиеся, так и в неделящиеся клетки, столовые клетки, зиготы и их делящиеся потомство. Коллекция векторов RNAi, которые супрессируют 50 человеческих ферментов позволила Thijn Brumme lkamp с коллегами изучить семейство генов и определить эти энзимы в значимых для опухолей путях ((Nature 2003; 424: 797-801). Эти исследователи обнаружили, что ген супрессор семейной цилиндроматозной опухоли, функция которого до сих пор была не известна, может способствовать активации фактора транскрипции NF-kappaB, что ведет к увеличению устойчивости к апоптозу. Они начали в настоящее время изучать использование ингибиторов этого гена в клинике. Способность эффективно и стабильно продуцировать и доставлять достаточные количества siRNA в надлежащие ткани-мишени нуждается в совершенствовании перед применением в клинике. Начальные исследования in vivo показали эффективную трансгенную супрессию синтезированными siRNA у взрослых мышей. В более недавнее время многие исследователи использовали плазмидные вирусные векторы для транскрипции коротких шпилечных РНК in vivo и in vitro. В этих системах экспрессии экспрессия генов более стабильно ингибировалась, чем у транзиентных нокдаунов, химически синтезированной siRNA. Должны вскоре последовать исследования на человеке, использующие эти последние открытия/50/ .

Интерференция РНК (RNAi) является последовательность – специфичным подавлением активности генов, индуцированным двухцепочечной РНК. Она представляет собой инструмент избирательного подавления экспрессии генов. Недостатками использования плазмидных ДНК, кодирующих siRNA, являются: ‘токсичность’, низкий уровень трансфекции по сравнению с химически синтезированными siRNA.

1.2.Техника микрочипов ДНК.

Микрочипы ДНК используются для одновременного определения уровней тысяч иРНК в образце. Коллекция таких измерений в различных клеточных типах и состояниях является надежным источником для функциональных предсказаний при том условии, что microarray эксперименты являются аналогичными, и образцы клеток достаточно разнообразны. Этот подход использовался для изучения стволовых клеток, чья идентичность и механизмы контроля не достаточно хорошо понимаются. Были получены данные Affymetrix microarray из более чем 200 образцов включающие стволовые клетки человека, мыши и их дериваты. С результатами исследования можно ознакомится online (StemBase; http://www.scgp.ca:8080/StemBase/)/31/.

Microarray технология быстро становится стандартной лабораторной техникой. Основные сложности, связанные с успешным применением этой технологии, относятся к анализу. В этой статье дан практически ориентированный обзор, посвященный анализу данных по большому числу генов. Описываются различные обычные методы кластеризации, и дается методика их использования. Обсуждаются методы оценки генов по их значимости на основании статистического анализа Microarray результатов. Рассматривается проблема выяснения биологического смысла результатов microarray экспериментов, и описываются современные инструменты, которые представляют различные, но надежные направления в обеспечении автоматических решений этой проблемы. Инструменты и подходы, представленные в статье, должны дать читателю предварительное понимание анализа результатов microarray экспериментов/20/.

Микрочипы ДНК используются для одновременного определения уровней тысяч иРНК в образце.

2.АССИМЕТРИЧНОЕ ДЕЛЕНИЕ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК.

Стволовые клетки получили особенно большое значение в течение последних лет, поскольку они представляют возможные инструменты для восстановления поврежденных органов. Эти клетки найдены не только в основных регенерирующих тканях, таких, как эпителий и кровь, но также в статических тканях, таких, как нервная система и печень, где они играют центральную роль в тканевом росте и сохранении. Механизм, с помощью которого стволовые клетки поддерживают популяции высоко дифференцированных короткоживущих клеток, как кажется, включает критический баланс между альтернативными путями (судьбами): дочерние клетки либо сохраняют идентичность стволовых клеток, либо инициируют дифференциацию. Недавние исследования на низших организмах выявили регуляторный механизм ассимитричных клеточных делений стволовых клеток. В этих моделях окружение, вероятно, обеспечивает ключевые инструктивные сигналы для выбора судьбы клеток. Наше понимание сейчас распространяется на внутренние механизмы клеточной полярности, которая влияет на ассиметричные деления стволовых клеток/12/.

Таким образом, судьба стволовых клеток у низших организмов, т.е. сохранение ими идентичности стволовых клеток или инициация дифференцировки решается в ходе ассимитричного клеточного деления.

3.ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ (ЭСК).

3.1.Самообновление ЭСК.

Самообновлеие мышиных ЭСК зависит от внешних сигналов: от лейкемического ингибиторного фактора (leukemia inhibitory factor (LIF)) и костного морфогенетического белка (bone morphogenetic protein (BMP)).Эти молекулы активируют, соответственно, перемещение в ядро латентного транскрипционного фактора STAT3 и экспрессию генов Id. Наоборот, белки гомеодомена Oct4 и недавно идентифицированный Nanog являются внутренними факторами, требующимися для поддержания недифференцированного состояния. При избыточной экспрессии Nanog позволяет ЭСК самообновляться в отсутствие в других случаях обязательных LIF и BMP сигналов. Однако наибольшая эффективность самообновления ЭСК имеет место, когда Nanog оверэкспессируется и клетки подвергаются действию LIF. Когда Oct4 оверэкспрессируется, ЭСК дифференцируются сходным образом при удалении LIF. Эти наблюдения сопоставлены для того, чтобы дать генетическую модель самообновления ЭСК, основанную на взаимодействиях между Oct4, STAT3 and Nanog/6/.

Oct4 и Mango являются внутренними факторами, требующимися для поддержания недифференцированного состояния ЭСК у мышей.

2.2.Дифференцировка ЭСК.

В нескольких последних работах использовали технику microarray, серийный анализ экспрессии генов (SAGE) и экспрессию свободных концов для получения характеристик транскриптома человеческих эмбриональных стволовых клеток и их дифференцированных производных. С помощью этих подходов получены ценные данные и выявлен факт, что большой процент генов остается не охарактеризованным в этих клетках, представляюших раннее развитие человека/36/.

ЭСК характеризуются своей способностью неограниченно размножаться в культуре, сохраняя нормальный кариотип и недифференцированное состояние. Они обладают потенциалом дифференциации в любой специализированный тип клеток тела. Знание транскрипционного профиля, связанного с плюрипотентностью и ранним развитием, необходимо для лучшего понимания их потенциала развития и поддержания недифференцированного состояния. В настоящее время существует несколько экспериментальных техник, используемых для определения профиля экспрессии генов в эмбриональных стволовых клетках. В этом обзоре суммирована информация, полученная с использованием техники microarray и других подходов по анализу экспресии генов в стволовых клетках у мыши и у линий человеческих клеток/33/.

ЭСК перспективны для лечения дегенеративных заболеваний человека. Поскольку ЭСК являются плюрипотентными, они могут быть проходить дифференцировку в определенное количество альтернативных клеточных типов с потенциальной терапевтической ценностью. Такие подходы, как “рационально направленная дифференциация ЭСК”, представляют собой попытки повторить аспекты нормального развития in vitro. Все дифференцированные клетки сохраняют идентичное содержание ДНК, хотя экспрессия генов широко варьирует от одного клеточного типа к другому клеточному типу. Поэтому действенная эпигенетическая система возникла для координации и поддержания типов тканево-специфичной экспрессии генов. Последние достижения показывают, что механизмы, которые управляют эпигенетической регуляцией экспрессии генов, имеют корни в динамике ремоделирования хроматина, а также метилирования ДНК. По мере дифференцировки эмбриональных клеток определенные гены активируются, в то время как активность других подавляется. Эти активирования и события подавления активности тесно скоординированы с локализацией клеточных линий. Ремоделирование хроматина регулируемых в развитии генов происходит в связи с определением линий. Ооциты, ранние эмбрионы и эмбриональные стволовые клетки содержат действенные хроматин - ремоделирующие активности. Это наблюдение заставляет предположить, что динамика хроматина может быть особенно важной для ранних решений по развитию линий. Динамика хроматина также связана с дифференцирвкой взрослых стволовых клеток. Сборка специлизированого хроматина тканевоспецифичных генов была изучена подробно. Через несколько лет должен быть достигнут ошеломляющий прогресс в понимании дифференциации стволовых клеток и биологии развития в отношении динамики хроматина/34/.

У взрослых млекопитающих имеются сотни клеточных типов, распределенных между органами, причем в каждой клетке содержится идентичное количество ДНК. Тем не менее, каждый из этих клеточных типов имеет уникальный образец экспрессии генов. Эпигенетика занимается влияниями на экспрессию генов, независимо от ДНК последовательности per se. В принципе гены ведут себя тремя способами в течение развития. Некоторые гены активируются в зависимости от клеточной линии, другие претерпевают подавление активности также в зависимости от клеточной линии, например, инактивация Х хромосомы или подавление активности таких эмбриональных генов, как Oct 4. И, наконец, активность генов “домашнего хозяйства” поддерживается постоянно. Хотя каждая клетка содержит одинаковое количество ДНК, способ ее упаковки с хромосомными белками (т.е. хроматин) существенно различается от клетки к клетке. Действительно, последние открытия в области исследования хроматина и клонирования (пересадка ядер) заставляют предположить, что большая часть молекулярного базиса тканевоспецифичной экспрессии генов связана с деталями структуры хроматина/34/.

Базовой субьединицей хроматина является нуклеосома, которая состоит из гистонового октамера, содержащего по паре стандартных гистонов H2A, H2B, H3 и H4 и 146 пар оснований ДНК. Хроматин может быть разделен на две фракции: эухроматин, который разрешает транскрипцию, и гетерохроматин, который запрещает ее. Гетерохроматин имеет две фракции: конститутивную и факультативную. ДНК в конститутивном гетерохроматине облигатно молчит. Примеры включают центромерные области и инактивированные повторяющиеся элементы, такие, как Alu, LINE и SINE элементы и инактивированные ретровирусы. По контрасту, факультативный хроматин молчит только в определенных контекстах. Примерами факультативного гетерохроматина являются тканевоспецифичные гены, которые молчат во всех, кроме определенной ткани. Гетерохроматин, по-видимому, имеет значительно большую молекулярную сложность, чем эухроматин. Большая часть эухроматина состоит из стандартных нуклосом, а гетоерохроматин состоит из модифицированных нуклеосом, в которых варианты гистонов замещают стандартные гистоны. Примеры включают варианты гистона H2A макроH2A1 и макроH2A2 и вариант гистона H3 CENP-A, который ассоциирован с центромерным гетерохроматином, а также гистоны H2A.X and H2A.Z. Гистон H2A.X фосфорилируется, когда ДНК повреждена, и отмечает места двухцепочечных разрывов в ДНК, в то время как H2A.Z защищает эухроматин от перехода в транскрипционно неактивную форму. Хроматин далее модифицируется путем добавления пострансляционых модификаций в гистоны, таких как метил-, ацетил-, фосфорил - и АДФ рибозидная группы. Модификации гистонов могут служить как cis-действующие связывающие места для вспомогательных факторов, таких как гетерохроматиновый белок 1, который связывается с гистоном H3 за счет метилирования по остатку лизина 9, что является основным биомолекулярным взаимодействием в гетерохроматине и контролируется Suv39h1 и Suv39h2 гистоновой метилтрансферазой. Метилирование гистонов также происходит в гистоне H3 в позиции 4 лизина, но в этом случае метилирование коррелирует с транскрипционной активностью. Сама ДНК может метилироваться в основном по остаткам цитозина в CpG динуклеотидах. Здесь также метилирование способствует биомолекулярным взаимодействиям между гетрохроматином и вспомогательными белками, такими, как MeCP2, and MBD1, 2 и 3.На молекулярном уровне тесные взаимосвязи существуют между хроматином и транскрипционным аппаратом. Важность транскрипционных факторов для активации генов бесспорна, но известно, что значительная часть транскрипционных факторов взаимодействуют со способствующими транскрипции ацетилтрансферазами. В результате появился взгляд, что модификация гистонов является переключателем для активации или репрессии экспрессии генов, сходно с путем, каким фосфаты переключают активацию или репрессию внутриклеточной сигнальной трансдукции. По мере того, как ЭСК претерпевают дифференцировку, они спонтанно выполняют регулируемые развитием программы экспрессии и подавления активности генов, которые координируются с изменениями в структуре хроматина. Изучение взрослых стволовых клеток дают свидетельство, что хроматин функционирует в специализированных событиях дифференцировки/34/.

Тотипотентность клеток млекопитающих пленяла воображение ученых в течение поколений. Длительно существовавший вопрос, сохраняют ли некоторые ядра соматических клеток тотипотентнсть, был разрешен клонированием Dolly в конце ХХ столетия. Рассвет ХХ1 века вызвал большие ожидания относительно использования тотипотентности в медицине. Через биологию стволовых клеток возможно создавать любые части человеческого тела путем инжиниринга стволовых клеток. Значительные ресурсы будут использованы для овладения неиспользованными потенциалами стволовых клеток в обозримом будущем, что может трансформировать медицину, какой мы знаем ее сегодня. На молекулярном уровне тотипотентность связана с фактором транскрипции и его экспрессия, по-видимому, определяет будет ли клетка тотипотентной. Oct4 может активировать или репрессировать экспрессию различных генов. Любопытно, что очень мало известно об Oct4, кроме его способности регулировать экспрессию генов. Механизм, с помощью которого Oct4 определяет тотипотентность, остается полностью не решенным/30/.

Развитие эмбриона млекопитающих контролируется регуляторными генами, некоторые из которых регулируют транскрипцию других генов. Эти регуляторы активируют или репрессируют экспрессию генов, которые опосредуют фенотипические изменения в течение дифференцировки стволовых клеток. Oct4 принадлжит к семейству факторов транскрипции POU. Семейство POU может активировать экспрессию их генов – мишеней путем связывания с октамерной последовательностью AGTCAAAT. Последние данные свидетельствуют, что Oct4 почти полностью экспрессируется только в эмбриональных клетках. В течение эмбрионального развития, Oct4 экспрессируется в начальной стадии во всех бластомерах. Затем его экспрессия оказывается ограниченной внутренней клеточной массой и снижается в трофектодерме и примитивной эндодерме. В зрелом возрасте, экспрессия Oct4 ограничивается только развивающимися зародышевыми клетками. Прицельное разрушение Oct4 привело к образованию эмбрионов без плюрипотентной клеточной массы, что заставляет предположить, что Oct4 необходим для поддержания плюрипотентности. Более того, количественный анализ экспрессии Oct4 выявил, что высокий уровень экспрессии Oct4 вызывает развитии эмбриональных клеток по линиям мезодермы и эндодермы; эмбриональные клетки с нормальным уровнем Oct4 остаются плюрипотентными; при низком уровне Oct4 эмбриональные клетки становятся клетками трофектодермы. Таким образом, было предположено, что Oct4 является ключевым регулятором плюрипотентности и дифференцировки стволовых клеток/30/.

Добавляется новая транскрипционная операционная система к известным системам Oct4 and Stat3, требующимся для действенности ранних эмбриональных стволовых клеток и их самообновления. Nanog, транскрипционный фактор, играет критическую роль во второй спецификации судьбы эмбриональных клеток, следующей за формированием бластоцита/5/.

ЭСК получают из внутренней клеточной массы перед имплантацией бластоцитов, они могут само обновляться и дифференцироваться во все клетки и ткани тела. ЭСК являются непревзойденным стартовым материалом критического, большей частью недоступного периода развития, так же, как и важным источником клеток для трансплантации и генной терапии. Несмотря на их потенциал, попытки получить специфические клеточные типы из ЭСК были только частично успешными из-за того, что, большое число комбинаций факторов роста и связанный с развитием контроль генов, участвующих в ограниченной дифференцировке клеточного типа, не известны. Некоторые недавние достижения в изучении дифференцировки ЭСК были сосредотечены на манипуляции факторами роста или генетических изменений в ЭСК для получения желательного фенотипа. Эти два подхода характеризуют современные научные интересы, касающиеся терапевтического использования этих клеток; генетические изменения создадут более чистые клетки, что увеличит вероятность злокачественной трансформации; эпигенетические методы часто не полны, и плюрипотентные клетки склонны образовывать тератомы. По мере того, как становится больше известно о спецификации линий в течение развития, будет возможно более точно контролировать спецификацию клеточного типа/54/.

ЭСК являются плюрипотентными стволовыми клетками, которые дифференцируются in vitro и in vivo в клеточные типы, происходящие из трех эмбриональных зародышевых слоев. ЭСК и родственные им клетки, клетки эмбриональной карциномы и эмбриональные зародышевые клетки, широко использовались, как модельные системы для изучения раннего развития млекопитающих. Эта работа привела к важным идеям о механизмах, контролирующих эмбриогенез на молекулярном и клеточном уровне. Впечатляющий прогресс был достигнут в изоляции и получении характеристик ЭСК разных видов, включая человека. Существенный прогресс был также сделан в развитии условий культивирования, которые способствуют дифференцировке ЭСК в специфические клеточные типы, которые образуются в ходе миогенеза, ангиогенеза, нейрогенеза и кардиогенеза. Способность инактивировать практически любой ген в ЭСК путем использования генов - мишеней очень улучшило понимание ролей специфических генов на клеточном и организменном уровне. Более того, ЭСК и клетки эмбриональной карциномы использовались широко для исследования того, как запускается и прекращается работа специфических генов в течение дифференцировки. В этой связи ДНК array технология использовалась для идентификации генов, регулируемых, когда ЭСК дифференцируются/35/.

ЭСК имеют способность самообновляться и дифференцироваться в клеточные дериваты эндодермальной, эктодермальнй и мезодермальной линий. ЭСК были использованы для анализа эффектов экзогенных факторов на путь развития в течение дифференцировки in vitro. При использовании подхода потери функции in vitro, основанном на дефицитных по бета1 интегрину ЭСК, было обнаружено, что интегрин-зависимые механизмы участвуют в экспрессии Wnt-1 и BMP-4. Антагонистические эффекты сигнальных молекул Wnt-1 and BMP-4, морфогенов участвующих в ранних событиях дифференцировки, изучались in vivo и in vitro: Wnt-1 действует как действенный индуктор мезодермы, в то время как BMP-4 играет критическую роль в детерминации нейроэктодермы .

Взаимодействие клеток с экстрацеллюлярным матриксом через детрминанты интегринов определяет экспрессию сигнальных молекул BMP-4 and Wnt-1, в результате чего происходит активация мезодермальной и нейроэктодермальной линий соотвественно. Результаты подтверждают идею, что влияние экстрацеллюлярной “ниши” на судьбу развития плюрипотентных стволовых клеток определяется не только растворимыми факторами, но также экстрацеллюлярным матриксом/8/.

Развитие плана тела контролируется большой сетью регуляторных генов. Рассматриваются данные о регуляторной сети генов, которая контролирует спецификацию эндодермы и мезодермы у эмбриона морского ежа. Сеть была создана на основании крупномасштабного пертурбационного анализа, в комбинации с компьютерными методологиями, данными геномики, cis-регуляторным анализом и молекулярной эмбриологией. Сеть содержит более 40 генов на настоящий момент, и каждое затруднение может быть прямо проверено на уровне последовательности ДНК cis-регуляторным анализом. Ее архитектура выявляет специфические и общие аспекты развития, такие, как данные клетки определяют их предопределенную судьбу в эмбрионе и почему процесс идет вперед во время развития/9/.

Относительный состав оснований ДНК регуляторных последовательностей недетерминированных полипотентных родоначальных клеток может иметь значение для частоты транскрипции этих генов при клеточной дифференцировке. Последовательности этих регуляторных областей генов клеточной детерминации, которые обогащены А-Т, создают потенциал для транскрипции из-за их более низко температуры плавления и склонности к связыванию. Одна или несколько групп высокой мобильности хроматиновых белков преимущественно связываются с богатыми АТ регуляторными последовательностями, что приводит к увеличению уровня транскрипции. Нефосфорилированные гистоны, реагирующие с теми же регуляторными сайтами, могут увеличивать частоту транскрипции. Уровень клеточного роста, т.е. суммарный белковый синтез клетки позитивно коррелирует с синтезом белков хроматина высокой мобильности. Синтез гистонов H1 связан с репликацией ДНК. Несбалнсированный рост изменяет количество белков высокой мобильности и H1 гистонов, таким образом, изменяя уровень транскрипции. Чем больше обогащение АТ последовательностями регуляторных областей генов клеточной детерминации, тем в большей степени АТ – обогащенные регуляторные последовательности ответственны за раннюю экспрессию генов клеточной детерминации в течение эмбрионального развития. Преимущественное связывание H1 гистонов с более АТ - обогащенными регуляторными последовательностями ограничивает их транскрипцию по сравнению с генами клеточной детерминации /14/.

ЭСК получают из внутренней клеточной массы перед имплантацией бластоцитов, они могут самообновляться и дифференцироваться во все клетки и ткани тела. Механизмы, которые управляют эпигенетической регуляцией экспрессии генов, имеют корни в динамике хроматина. Oct4 может активировать или репрессировать экспрессию различных генов ЭСК. Влияние экстрацеллюлярной “ниши” на судьбу развития плюрипотентных стволовых клеток определяется не только растворимыми факторами, но также экстрацеллюлярным матриксом. Развитие плана тела контролируется большой сетью регуляторных генов. Существенный прогресс был также сделан в развитии условий культивирования, которые способствуют дифференцировке ЭСК в специфические клеточные типы.

4.ГЕМАТОПОЭТИЧЕСКИЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ (ГСК).

Гематопоэтические стволовые клетки (ГСК) самообновляются в течение всей жизни, но нет точного понимания молекулярных механизмов, посредством которых этот процесс происходит и регулируется. На основании опубликованных данных об экспериментах по оверэкспрессии и нокауте описываются гены, которые влияют на самообновление стволовых клеток, включая факторы транскрипции, регуляторы клеточного цикла гены, влияющие на структуру хромосом. Одна из моделей предлагает, как эти различные классы молекулярных регуляторов могут быть интегрированы, концентрируясь на роли движения по G1/S при переключении развития в сторону самообновления в противоположность дифференцировке/45/.

В течение многих лет взрослые гематопоэтические клетки рассматривались “пластичными” в их способностях к пролиферации и дифференцировке. В последнее время было сообщено о данных, которое подтверждает более новые концепции пластичности взрослых стволовых клеток. В частности, стволовые клетки из гематопоэтических тканей имеют “выдающиеся’ способности генерировать или переключать развитие между гематопоэтическими и негематопоэтическими линиями, демонстрируя неожиданную степень потенциала развития или дифференцировки. Механизмы, с помощью которых репрограммируется судьба ГСК, все еще плохо понимаются. Тем не менее, увеличивающееся количество исследований бросает вызов одной из основных догм биологии, что дифференцировка клеток млекопитающих следует установленной программе иерархическим образом, и если клетка принадлежит одной клеточной линии, она не переходит в другую соматическую линию. “Неиерархический”, “обратимый” фенотип в гематопоэических тканях, если он существует, представляет собой преимущество, которое может быть использовано в регенеративной медицине/27/.

Способность поддерживать самообновление – генерацию дочерних клеток, имеющих те же регенеративные способности, как и родительская клетка – это определяющая черта ГСК. Существует сильное доказательство, что самообновление ГСК находится под внешним биологическим контролем in vivo. Ряд цитокинов, морфогенетических лигандов и ассоциированных сигнальных компонентов влияет на самобновление в культуре и in vivo. Специфические транскрипционные факторы действуют как мощные внутренние агонисты самообновления ГСК in vitro и in vivo, когда добавляются либо трансдуцирующие сДНК или поступающие извне белки. Эти открытия дают инструменты для углубления знаний о механизме и для достижения клинически полезных уровней экспансии ГСК/38/.

Человеческие CD34+ гематопоэтические стволовые и прогениторые клетки способны к поддержанию пожизненного запаса полного спектра клеток крови в зависимости от системных нужд. Последние исследования заставляют предположить, что ГСК, кроме своего гематопоэтического потенциала, способны дифференцироваться в негематопоэтические типы, что открывает новое направление в клеточной терапии. Иммунофлуоресцентный анализ, культуральные анализы, и трансплантационные модели позволяют дать всестороннюю имунологическую и функциональную характеристику ГСК и прогениторных клеток. Новые методы, такие как сДНК array технология продемонстрировали, что экспрессия отдельных генов транскрипционных факторов и клеточного цикла контролируют на молекулярном уровне самообновление, дифференцировку и пролиферацию. Более того, было показано, что несколько молекул адгезии играют важную роль в регуляции траффика гематопоэза и стволовых клеток. Прогресс также был сделан в определении молекулярных механизмов старения стволовых клеток, которое ограничивают репликативный потенциал/44/.

Две характеристики определяют гематопоэтические стволовые клетки: способность дифференцироваться во все гематопоэтические линии и способность поддерживать гематопоэз пожизненно за счет механизма самообновления. Механизмы, которые регулируют судьбу образующих кровь клеток in vivo, однако плохо понимаются. Несмотря на возможность культивировать гематопэтические прогениторные клетки, принадлежащие к определенным линиям, не удалось получить культуры in vitro самообновляющихся мультипотентных клеток. Что ясно, так это то, что и внутренние, и внешние сигналы регулируют судьбу ГСК и что некоторые из этих сигналов еще не были идентифицированы/48/.

Системы стволовых клеток представляют эффективный и мощный подход к развитию тканей и регенерации различных типов тканей. Общей и определяющей чертой этих исключительных клеток является способность к самообновлению и потенциал для дифференцировки во множественные зрелые типы клеток. Недавно удивительные новые наблюдения указали, что стволовые клетки, изолированные из одной взрослой ткани, могут также дать начало зрелым клеткам других клеточных линий, независимо от назначения классического зародышевого слоя. Это открытие привело к скачку как в научном знании, так и в потенциальных приложениях стволовых клеток. Эти новые открытия противоречат центральной догме о предопределении и дифференциации стволовых и прогениторных клеток. Однако истинный потенциал соматических стволовых клеток только начинает проясняться, и эти открытия должны быть более полно определены и интегрированы в объединенную модель потенциала и поведения стволовых клеток. Анализируется потенциал развития ГСК мыши и человека после их инъекции в мышиный неимплантационный бластоцит, окружение, которое позволяет развитие всех клеточных линий. Обсуждаются появляющиеся данные о пластичности развития ГСК и других соматических стволовых клеток, и рассматривается вопрос о том, как устанавливается клеточная память о состояниях транскрипции, и как она может потенциально участвовать в этом феномене/1/.

Хроническая миелоидная лейкемия является нарушением клонирования в плюрипотентных ГСК, признаком которой является конституционно активированный p210-тип Bcr-Abl белка тирозин-киназы. Исследования последних лет помогли нам понять молекулярные процессы, участвующие в инициации и прогрессировании хронической миелоидной лейкемии. Хотя было накоплено большое количество знаний, влияние Bcr-Abl на ГСК все еще не ясно. Создана система дифферециации ЭСК и индуцированной тетрациклином экспрессии Bcr-Abl. Вынужденная Bcr-Abl экспрессия была достаточной для увеличения числа как многолинейных прогенаторов, так и миелоидных прогенаторов. Данная система является мощным инструментом анализа генетических изменений во время гематопоэтического развития/11/.

Две последние декады были свидетелями значительного прогресса в понимании клеточной физиологии и молекулярной регуляции гематопоэза. В основе самообновления стволовых клеток и принятия решений о выборе клеточной линии лежат относительные уровни экспрессии линия - специфичных транскрипционных факторов. Экспрессия этих транскрипционных факторов у ранних стволовых клеток может быть разной и неустойчивой, но, в конечном счете, попадает под влияние внеклеточных регуляторных сигналов в форме гематопоэтических цитокинов. Описываются ключевые известные трнскрипционные факторы, управляющие самообновлением и определением линий стволовых клеток. В итоге возникает картина дифференцировки ГСК, в которой решения о судьбе стволовых клеток, управляющихся интегральными эффектами внутренних транскрипционных факторов и внешних сигнальных путей, инициируемыми регуляторными цитокинами/52/.

Все взрослые клетки крови происходят из небольшой популяции самообновляющихся плюипотентных ГСК. Способность к самообновлению характеризует все стволовые клетки, нормальные и неопластические. Интересно, что последние исследования заставляют предположить, что самообновление необходимо для поддержания опухолевых клеток, что подразумевает, что этот процесс имеет клиническое значение. К сожалению, молекулярные основы самообновления клеток позвоночных остаются плохо определенными. Этот обзор сосредоточен на механизмах развития, лежащих в основе гомеостаза эмбриональных и взрослых ГСК. Конкретно, различия между генетичекими программами, регулирующими ГСК спецификацию (идентичность), самообновление (у эмбрионов и у взрослых) и дифференциацию будут обсуждены со специальным акцентом на регуляторах транскрипции и хроматина/24/.

Представлена контролируемая компьютером цейтраферная система для изображения культивируемых гематопоэтических клеток, меченных для экспрессии различных флуоресцирующих белков. Во-первых, описаны эксперименты по оптимизации визуализации трех вариантов зеленых флуоресцирующих белков (циан-, зеленый и желтый усовершенствованный флуоресцентный белок) и красный флуоресцентный белок (DsRed) с помощью стандартной с широкой областью регистрации флуоресцентной микроскопии. Во-вторых, описаны процедуры для лучшего распознавания комбинаций клеток, экспрессирующих эти белки, с использованием семи коммерчески доступных комплектов фильтров, основанные на относительных интенсивностях флуоресценции индивидуальных флуоресцентных белков. Даны рекомендации о том, какие из этих фильтров выбирать при работе со специфическими флуоресцентными белками /43/.

Существуют большие генетически детерминированные количественные вариации в числе и функции гематопоэтических стволовых клеток в инбредных линиях мышей. Более того, старение гематопоэтических клеток генетически детерминировано. Генная идентификация в характерных локусах (местоположениях), участвующих в регуляции и старении гематопоэтических стволовых клеток обеспечит новые инсайты в регуляторные механизмы, которые имеют значение in vivo и могут быть клинически важны. Описаны стратегии для картирования и идентификации генов характерных локусов, которые участвуют в регуляцию гематопоэтических стволовых клеток/42/.

Таким образом, главными проблемами молекуоярной биологии ГСК, как и ЭСК, являются механизмы самообновления и дифференцировки. Особый интерес вызывает свойство ГСК давать как гематопоэтические, так и негематопоэтические линии. В клинике, конечно, наиболее перспективно применение стволовых клеток, имеющих генотип, идентичный генотипу реципиента. Таковыми могут быть либо ЭСК, полученные клонированием с мспользованием ядер соматических клеток реципиента, либо, если говорить о стволовых клетках самого реципиента, прежде всего ГСК.

5.ВЗРОСЛЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ.

Как полагают, стволовые клетки важны для регенерации нескольких взрослых тканей. Недавно взрослые стволовые клетки с очень широким потенциалом дифференцировки были идентифицированы, однако представляют ли они рудиментарные примитивные плюрипотетные стволовые клетки или исключительно редкие случаи дедифферецировки, включающие тканево-специфичные стволовые клетки, не известно. Трансдифференцировка тканево-специфичных стволовых клеток через границы линий была также продемонстрирована, но сравнительная неэффективнсть процесса in vivo, даже при наличии повреждения ткани, ставит вопрос, имеет ли этот механизм физиологическое значение. Интересно, что среди взрослых стволовых клеток способность к перемене линий наиболее велика у стволовых клеток, которые могут быть культивируемы ex vivo в течение продолжительных периодов времени. Если у нормальных клеток решения о судьбе о различных типов взрослых стволовых клеток могут быть надежно изменены с высокой частотой in situ, можно представить себе регенеративые терапии для широкого разнообразия болезней. Интегрированне понимания транскрипционной регуляторной сети, которая включает различные стволовые клетки, также как сигнальные пути, управляющие их дифференцировкой в терапевтически полезные клеточные типы, будет способствовать клиническим приложениям этих волнующих открытий/4/.

Таким образом, выявлены взрослые стволовые клетки(субэпиндимальный слой мозга, олфакторный эпителий и т.д.) с очень широким потенциалом дифференцировки, а также обнаружен феномен трансдифференцировки через границы линий.

6. ВОССТАНОВЛЕНИЕ ТКАНЕЙ.

Целью регенеративной медицины является восстановление формы и функции поврежденных тканей. Один потенциальный терапевтический подход включает использование аутологичных клеток, полученных из костного мозга. Прогресс в трансплантации ядер, образование экспериментальных гетерокариотических клеток и наблюдаемая пластичность экспрессии генов и фенотипа у различных типов свидетельствует о пластичности ядра. Последние исследования расширили эти открытия и показали, что эндогенные клетки в костном мозге обладают способностью включаться в дефектные ткани и репрограммироваться. Независимо от механизма потенциал для новой экспрессии генов в клетках из костного мозга в тканях – реципиентах обещает развитие клеточной терапии как в пролиферирующих, так и в пост - митотических тканях /32/.

Стволовые клетки, представляющие наибольший интерес с точки зрения их применения в медицине, - это эмбриональные, гемопоэтические и мезенхимальные. Стволовые клетки - это недифференцированные клетки, способные как к самоподдержанию, так и к дифференцировке в зрелые специализированные клетки. По типу происхождения различают эмбриональные и соматические стволовые клетки. Первые могут неограниченно поддерживаться в культуре и способны к дифференцировке во все клетки взрослого организма. Вторые обладают ограниченной способностью к дифференцировке и, возможно, ограниченным пролиферативным потенциалом. Важным для терапевтического применения, хотя и оспариваемым рядом ученых, свойством является пластичность соматических стволовых клеток, т.е. способность к контекст - зависимой дифференцировке в “неродственные” типы клеток. Предполагается, что дифференцировка большинства типов стволовых клеток происходит по принципу поэтапного иерархического созревания через промежуточные интенсивно пролиферирующие клетки - предшественники. Применение стволовых клеток в медицине находится в основном на стадии преклинических исследований. Несмотря на перспективность эмбриональных стволовых клеток, ряд обстоятельств серьезно ограничивает их терапевтическое применение в ближайшем будущем. В то же время подходы, связанные с аутотрансплантацией гемопоэтических или мезенхимальных стволовых клеток, уже начинают успешно использоваться в клинических испытаниях для лечения ишемии конечностей и последствий инфаркта миокарда. Очевидно, что применение стволовых клеток в медицине обещает кардинальный прогресс в лечении множества тяжелых заболеваний /28/.

Стволовые клетки продолжают привлекать значительное внимание и подают надежду на развитие новой основанной на клетках терапии для дегеративных болезней. Для использования полного терапевтического потенциала стволовых клеток требуется понимание механизмов, посредством которых они генерируются, самообновляются и дифферецируются. Приложение пост - геномных технологий начало приводить к пониманию природы молекулярного состояния различных компартментов стволовых клеток. Одна из возникших тем - значительная молекулярная сложность, в которой начинаются многие возможные пути дифференцировки, обеспечивая одну возможную стратегию того, чтобы была возможна различная реактивность стволовых клеток. Эта новая информация в конечном счете должна выявить любой общий атрибут стволовых клеток и помочь в рациональных подходах манипулирования стволовыми клетками в терапевтических целях/19/.

Восстановление тканей – это процесс, когда множество поврежденных типов клеток замещается для восстановления гистоархетоктоники и функции ткани. Несколько теорий было предложено для объяснения феномена тканевого восстановления у амфибий и животных, относящихся к высшим классам. Эти теории включают дифференциацию поврежденных тканей, трасдифференцировку входящих в клон клеток – предшественниц и активацию резервных клеток-предшественниц. Исследования Young et al. и других показали, что компартменты соединительной ткани во все время постнатального развития содержат резервные клетки- предшественницы. Последовательное повторяющееся одноклеточное клонирование и исследования по сортировке клеток выявили, что эти резервные клетки – предшественницы состоят из множественных популяций клеток, включающих тканево-специфичные клетки – предшественницы, зародышевый слой потомства стволовых клеток и плюрипотентные стволовые клетки. Тканево-специфичные клетки- предшественницы демонстрируют различные способности к дифференцировке, от унипотентности (образуя один клеточный тип) до полипотентности (образуя множественные клеточные типы). Однако, все клетки - предшественницы демонстрируют конечную продолжительность жизни от 50 до 70 удвоений популяции перед программируемыми старением и смертью. Линия зародышевого слоя стволовых клеток может образовывать более широкое разнообразие клеточных типов, чем клетки – предшественницы. Индивидуальная стволовая клетка зародышевой линии может образовывать все соответствующие клетки линии зародышевого слоя (т.е. эктодерму, мезодерму или эндодерму). Плюрипотентные стволовые клетки могут давать большее разнообразие клеточных типов, чем единственная стволовая клетка зародышевой линии. Единственная плюрипотентная стволовая клетка может образовывать клетки, принадлежащие всем трем линиям зародышевых слоев. Как стволовые клетки линии зародышевого слоя, так и плюрипотентные стволовые клетки демонстрируют повышенные способности к самообновлению, далеко превосходящие продолжительность жизни клеток – предшественниц (50-70 удвоений популяции). Авторы предполагают, что активация покоящихся тканевоспецифичных клеток – предшественниц, стволовых клеток линии зародышевого слоя и/или плюрипотентных стволовых клеток может послужить потенциальным объяснением, совместно с дедифференцировкой и трансдифференцировкой процесса восстановления тканей. Сегодня исследуются несколько модельных систем для определения возможностей использования взрослых покоящихся резервных клеток - предшественниц для тканевой инженерии /51/.

Таким образом, процесс восстановления тканей объясняется активацией покоящихся тканевоспецифичных клеток – предшественниц, стволовых клеток линии зародышевого слоя и/или плюрипотентных стволовых клеток

7.ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПРИ СТАРЕНИИ.

Исследования по выявлению генов, регулирующих стволовые клетки, обычно принимают одну из двух различных линий исследования: прямой и обратный генетические подходы. Прямой генетический подход движется от измеримых фенотипических различий к генетическому полиморфизму, а обратный генетический подход использует обратную генетику. Число недавно открытых локусов, ответственных за стволовые клеточно-специфичные фенотипы и функции быстро увеличивается вследствие успехов обоих подходов. Эти локусы регулируют стволовые клетки за счет внутренних (клеточноавтономных)и/или внешних механизмов и диктует решения, определяющие клеточную судьбу. В течение процесса старения стволовые клетки претерпевают количественные и качественные изменения. Можно выдвинуть гипотезу, что скорость старения и продолжительность жизни организма определяется обоими этими обстоятельствами/25/.

Таким образом, в течение процесса старения стволовые клетки претерпевают количественные и качественные изменения.

8.ЛАМИНЫ.

Ген LMNA кодирует белки ламины А и С, которые участвует в 9 различных ламинопатиях – наследственных заболеваниях, которые связаны с преждевременным старением. Последние данные демонстрируют, что ламины А и С имеют важнейшие функции в зашите клеток от физического повреждения, а также поддерживают функцию транскрипционных факторов, требующуюся для дифференцировки взрослых стволовых клеток. Дегенеративная природа ламинопатий объяснена, потому что эти ламины сушественно важны для поддержания соматических тканей во взрослом состоянии/17/.

Таким образом, ламины имеют важнейшие функции в зашите клеток от физического повреждения, а также поддерживают функцию транскрипционных факторов, требующуюся для дифференцировки взрослых стволовых клеток.

9.ФАРМАКОГЕНОМИКА.

Терапевтическое применение стволовых клеток представляет новый подход к лечению множества генетических и дегенеративных болезней. Возникновение фармакогенетики обещает оптимальный индивидуализированный лечебный режим для широкого разнообразия патологий. Это создает новую нишу в терапевтическом медицинском исследовании, фармакогеномику. Развитие этого направления требует применения существующих технологий геномики, протеомики и биоинформатики к решению различных проблем, связанных с терапевтическими применениями стволовых клеток /2/.

Таким образом, на базе фармагенетики создано новое направление – фармакогеномика.

10.ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ И СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ.

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) являются клоногенными, негематопоэтическими стволовыми клетками, присутствующими в костном мозге, и они способны дифференцироваться во множественные мезодерального типа клеточные линии, например, остеобласты, хондроциты, эндотелиальные клетки и также немезодермального типа линии, например, нейроноподобные клетки. Несколько методов сейчас доступно для изоляции МСК, основанные на их физических и физико-химических характеристиках, например, сцеплению с пластмассами или другими внеклеточными матриксными компонентами. Из-за легкости их изоляции и их большого потенциала дифференцировки, МСК находились среди первых стволовых клеток, использовавшихся в клинике. Несколько исследований продемонстрировали возможное использование МСК в систематической трансплантации для системных болезней, локальной трансплантации для локальных тканевых дефектов, и как переносчик генов в протоколах генной терапии или для генерации трансплантабельных тканей и органов в протоколах тканевого инжиниринга. Перед тем, как широко использовать их в терапии, должны быть созданы методы, позволяющие генерировать большое число клеток, не влияющие на их потенциал дифференцировки, так же, как технологии, позволяющие преодолевать иммунологическое отторжение (в случае аллогенных трансплантантов)/21/.

Последние исследования показали, что продолжительность жизни мезенхимальных стволовых клеток span может быть увеличена путем увеличения уровней экспрессии теломеразы в клетках, и тем позволяя культуре накопить большее число клеток, необходимых для терапии. Дополнительно, было показано, что, возможно, культивировать клетки в ксено - окружении без влияния на их рост и потенциал дифференцировки. В заключение, мезенхимальные стволовые клетки кажутся гипоиммуногенными, и поэтому аллогенный трансплантант из мезенхимальных стволовых клеток возможен /22/.

В последние две декады способность переносить гены в ГСК обеспечила новые инсайты в поведение индивидуальных стволовых клеток и послужила основой новых подходов к лечению различных наследственных или приобретенных заболеваний. В настоящее время перенос в ГСК был достигнут в основном с помощью модифицированных ретровирусов. В то время как основанные на ретровирусах векторы могут эффективно трансдуцировать мышиные ГСК, экстраполяция этих методов к большим млекопитающим и человеку показала в клинических испытаниях, что они ведут к очень небольшому числу маркированных генами приживленных клеток. Дополнительно, in vitro оценки с помощью прогениторных клеток были найдены обладающими низкой предсказательной силой по отношению к исходу переноса генов в стволовые клетки. Внимание быстро переместилось к развитию превосходящих и более информативных преклинических анализов в исследовании переноса генов в человеческие стволовые клетки. Ксеногенные трансплантационные модели и системы трансплантации у больших млекопитающих оказались бесценны. Развитие лучших методов для оценки протоколов человеческой генной терапии и лучшего понимания стволовых клеток и векторной биологии нашло свою кульминацию в последней декаде во множественных стратегиях для улучшения эффективности пере

Фундаментальная медицина

Информация с сайта: Не указан
Просмотров: 2247
Печать
Сообщить другу

(1 голосов)



Справочник
Каталог предприятий
Популярные статьи
ГИЖЖА ВА УНИ ДАВОЛАШ УСУЛЛАРИ.
Гижжалар—одам, хайвон ва усимликларда касаллик кузгатувчи  паразит чувалчанглар.
Буг

Ошкозон ости бези касалланганда еки « Панкреатит »да пархез
Ошкозон ости бези касалланганда еки « Панкреатит »да пархез. Ошкозон ости  бези ял
ТАБИИЙ НИКОБЛАР – ЮЗ ТЕРИСИНИ ЁШАРТИРАДИ.
“Илик узилди” даври, илк баҳор чоғлари ҳар қандай турдаги тери у
КЎКРАК БЕЗЛАРИДАГИ ОГРИКЛАР САБАБИ ВА ДАВОСИ
Кўкрак безидаги оғриқлар аксарият аёлларни безовта қилганлиги аниқ. Биро
УТКИР БРОНХИТЛАР
Уткир бронхит--- бронхларнинг уткир яллигланиши.
Бу нафас органларининг  энг куп учрайдиг




Опрос пользователей
Как Вы оцениваете этот справочник?
Отлично
Хорошо
Надо подумать
Надо доработать
Захожу на сайт первый раз
Нет ответа


Облака тегов


Логин:
Пароль: